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技术前沿:BMG & Promega合作推出活细胞CRISPR/Cas9基因编辑&NanoBRET实时监测助力PROTACs药物筛选
来源: Admin    更新时间: 2020-07-02    浏览: 59 人次
近年来,生物创新药研发药物靶标重点已从传统药物靶标,如G蛋白偶联受体,激酶和离子通道转向更具挑战性的“不可成药”重要靶标蛋白。

蛋白降解靶向嵌合体Proteolysis targeting chimeras (PROTACs)作为一种异双功能分子,因其可以利用天然的泛素-蛋白酶体途径选择性降解目标
蛋白,近年来成为新药研发重点关注新技术(图1)1。这对以往所谓“不可成药”药物靶标,如在重大疾病扮演重要角色的转录因子,骨架蛋白和
调节蛋白等非酶类重要蛋白,进行新方向药物开发具有重大意义。
  


图1,PROTAC介导的靶标蛋白泛素化降解过程示意图1

>PROTAC异双功能分子包括:可结合泛素连接酶E3的配体,可结合靶标蛋白的配体和连接两种配体的连接器Linker
>RROTAC与靶标蛋白和泛素连接酶E3形成三元复合物,进而可以引起靶标蛋白的泛素化
>泛素化的靶标蛋白通过细胞内天然的蛋白酶体系统降解。释放的PROTAC和泛素连接酶E3会被重新再利用
Megan Scudellari, Nature News,2019

然而,利用PROTACs进行新药研发,虽然前景被十分看好,并取得了越来越多的突破性成果,但是相关研发工作仍然存在大量分子设计与优化等挑战
性工作,包括深入了解PROTACs具体作用机制,设计优化出可更加有效介导靶标蛋白降解的PROTACs,选择合适的泛素连接酶及优化靶标蛋白泛素化等工作。

对此,BMG & Promega公司合作推出PROTACs相关药物研发新方案,通过BMG最新一代,超灵活,超灵敏,多功能酶标仪
CLARIOstar Plus-ACU,结合CRISPR/Cas9基因编辑和NanoBRET技术,在活细胞内实时监测PROTACs介导三元复合物的结合过程和靶标蛋白泛素化
与降解过程(图2)2



图 2. A, PROTAC介导的靶标蛋白泛素化降解过程标注图;B, 在活细胞内,PROTAC介导三元复合物形成时,泛素链接酶偶联的荧光基团HaloTag与
靶标蛋白偶联的NanoBit荧光素酶形成NanoBRET反应发光信号。同样,可将HaloTag标记在泛素上,当偶联NanoBit荧光素酶的靶标蛋白被泛素化时,
可形成NanoBRET反应发光信号。

结合CRISPR/Cas9基因编辑技术,可为不同蛋白添加HiBit标签。如通过为拥有巨大潜力的新药研发靶点BRD4蛋白添加HiBit标签,HiBit标签再可通
过和细胞稳定表达的LgBit重组形成NanoBit荧光素酶。配合质粒表达系统表达HaloTag标记的泛素连接酶VHL或泛素,可通过活细胞实现实时
NanoBRET监测,用于优化分析PROTAC介导的三元复合物结合情况与泛素化过程。



图 3. CLARIOstar Plus-ACU实时监测NanoBRET,分析PROTAC分子介导的BRD4和VHL三元复合物形成过程(A)和靶标蛋白BRD4泛素化实时过
程(B)。数据显示,PROTAC分子ARV-771在非常低的浓度即可有效介导三元复合物的形成及后续泛素化过程,整个过程可被该方案灵敏稳定地实
时监测分析。

然而,虽然PROTACs已经开发出很多成功的例子,但仍有大量优化工作要做。特别是很多PROTACs相关研发工作都是在特定时间点和特定浓度条件
下,进行相关的药物筛选。类似方案,不仅耗时耗力,并且结果难以精准预测。因为检测特定时间点问题,很多关键重要的生物学过程会被忽略。
考虑到泛素化介导蛋白降解过程的复杂性,能够结合活细胞实时分析PROTACs效力及其介导靶标蛋白的降解过程具有极其重要意义。Promega
公司研发人员结合BMG CLARIOstar-ACU,CRISPR/Cas9基因编辑技术和其特有的NanoBRET技术近来开发出一种新的方案,用于解决活细胞
内实时监测分析PROTAs介导靶标蛋白降解全过程(图4),相关文章已发表3。该方案通过活细胞实时监测,不仅可分析靶标蛋白最大降解程度,
最大程度降解时间,蛋白降解逆转过程等信息,同样可为分析泛素化过程,PROTACs介导的三元复合物结合强度与稳定性,泛素连接酶特异性
选择,PROTACs分子优化设计,药物分子优化设计等工作提供重要参考信息,可为基于PROTACs进行创新生物药研发提供具有重大应用价值
的解决方案。



图4文章“Quantitative Live-Cell Kinetic Degradation and Mechanistic Profiling of PROTAC Mode of Action”图文摘要

德国BMG最新一代多功能酶标仪CLARIOstar Plus ACU:标配专利线形渐变滤光片光栅LVF技术,拥有市场荧光/发光检测灵敏度和灵活性的最佳整
合。同时,在发光检测灵敏度,孔间干扰控制,顶读/底读自动聚焦检测等综合方面具备最佳性能。配合最灵活精密的气体调控技术,可为基于活细
胞相关荧光和发光实验分析提供最佳解决方案。曾先后在多种应用方案中获得Promega公司认可推荐或用于其相关研发工作中:

Promega NanoBRET活细胞实时分析助力PROTACs药物研发所用机型:

NanoBRET技术唯一获得Promega认可的光栅(LVF)检测机型:

Promega活细胞实时分析细胞状态方案推荐机型:

参考资料:
1,Megan Scudellari, An emerging class of drug could send some of medicine’s most troublesome protein targets to the cellular rubbish bin. Nature  News,2019
2,Kristin M. Riching, . et al. Promega, Madison, WI, U.S.A,BMG Application Note 2020
3,Riching, K.M. et al. Quantitative Live-Cell Kinetic Degradation and Mechanistic Profiling of PROTAC Mode of Action. 
ACS Chem. Biol. (2018) 13: 2758-2770.
 
 
 
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