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ApogeeMix:流式微球金标准
来源: Admin    更新时间: 2019-09-20    浏览: 80 人次

细胞外囊泡和外泌体的流式检测方法已经逐渐流行起来,因为流式细胞仪不仅可以检测囊泡的大小、数量,而且通过细胞特异的标记物染色可以检测囊泡的来源,将囊泡进行分类,因此,流式细胞仪理论上是进行囊泡快速、高通量、多参数检测的最优选择。


利用流式细胞仪进行细胞外囊泡检测往往需要使用标准微球(microspheres)来校正和设门(SetGate),常用的微球材料有聚苯乙烯(Polystyrene)和二氧化硅(silica),国际血栓与止血协会和标准化委员会(ISTH SSC)推荐用于循环微粒(微囊泡)检测设门的Megamix就是聚苯乙烯微球。但是,最近越来越多的研究人员发现,用标准微球进行设门存在很严重的偏差,因为不同材料的微球的折射率(refractive index)是不一样的,相同直径的微球,折射率越大产生的散射光就越强。而且微球的折射率要远远大于生物囊泡的折射率,意味着微球产生的散射光强度是相同直径囊泡的几十倍。实际上,0.5mm聚苯乙烯微球(Megamix)产生的散射光强度相当于1.4mm的囊泡,而2.7mm的囊泡才能产生跟0.9mm聚苯乙烯微球(Megamix)相当强度的散射光(表1)[1]。因此,如果我们用0.5mm的聚苯乙烯微球(Megamix)设门来检测小于0.5mm的细胞外囊泡将产生严重的偏差,检测结果也是不可信的。而二氧化硅的折射率更接近于生物囊泡的折射率,因此二氧化硅微珠可以作为较好的参考粒子。


 

*FSRI, forward scatter relative intensity measured on the Apogee A40. **Diameter of a lipid or cellular microparticle with the same forward scatter relative intensity as the particle that was measured. Equivalent microparticle diameter (mm) = 3.2911(PD) - 0.2768, where PD = polystyrene microsphere diameter (mm).


英国Apogee Flow公司的ApogeeMix (Cat #1493)标准微球是一种非常成熟易用的混合标准微球:包括荧光标记的乳胶微球和无荧光标记的二氧化硅标准微球,粒径范围涵盖110nm到1300nm之间不同大小的标准微球。这种混合标准微球不仅可提供简便的方法来评估流式细胞仪散射光和荧光的灵敏度及分辨率,同时,内含多种不同大小的纳米级二氧化硅标准微球,更是可以更接近生物样品折射率的折射率(1.43)对流式细胞仪进行散射光校准,现已成为微小生物纳米颗粒流式分析的金标准参考微球。


ApogeeMix标准微球组成:

25ml的混合标准微球溶液,内含折射率ɳ=1.43,直径分别为180nm、240nm、300nm、590nm、880nm和1300nm的二氧化硅标准微球,以及折射率ɳ=1.59,直径分别为110nm和500nm的488激光激发的绿色荧光标记乳胶微球。该产品可以很好地用于评估流式细胞仪散射光和荧光的分析性能(灵敏度和分辨率)。下图1是在Apogee A50-Micro流式细胞仪上分析的ApogeeMix典型数据(FL1=绿色荧光)。


绿色荧光标记的乳胶微球可用于评估流式细胞仪荧光灵敏度和不同折射率背景下的光学分析性能。

图1:不同大小标准微球在峰形图中的分辨率可很好地展现流式细胞仪的分析性能。理想情况下,8种不同大小的标准微球峰形群应相互分离,并可与仪器噪声明显区分开:

6种大小,折射率为1.43的二氧化硅微球和2种大小(110nm和500nm),折射率为1.59的绿色荧光乳胶微球(488nm激光激发)(中间图)。


为了更精确地检测生物囊泡大小(折射率通常在1.36到1.40之间),英国Apogee纳米流式细胞仪的工程师们研发了专利的折射率校正功能,无论是单参数的柱状图(Histogram)还是双参数的散点图(Cytogram),只要单击右键选择“Choose Calibration Scale”就会出现一条校正大小的标尺,并且可以根据检测样本的折射率来选择相应折射率的标尺(图2),那么我们就可以根据样本的直径大小和折射率这两个参数来设门和选择我们感兴趣的区域(region of interest, ROI),得到真实可靠的结果。

图2.折射率分别为1.38和1.42的微粒(180, 240,300 ,590, 880, 1300, 2000nm)在散点图中的位置。


那么市面上的流式细胞仪是否都适合进行细胞外囊泡和外泌体的检测?


首先,细胞外囊泡(Extracellular Vesicles, EVs)直径从40nm到1000nm不等,胞外囊泡直径约为100nm–1000nm,外泌体直径约为40nm - 100nm。对传统的流式细胞仪来说,散射光的检测极限通常是300-500nm,无法将大多数细胞外囊泡与背景噪音区分,直径小于300nm的细胞外囊泡很难被检测到[2]。


其次,我们来看一组流式细胞仪散射光技术对比:

图 3. Technological improvement in forward scatter (FS) for microparticle (MP) measurement: (A) Beads resolution improvement: FS distribution of a blend of fluorescent latex beads (0.1/0.14, 0.3, 0.5 and 0.9 μm) with a threshold on fluorescence. (B) Background noise reduction: Scatters dot plot showing blue (0.9 μm beads), red (0.5 μm beads), green (0.3 μm beads) and violet (0.1/0.14 μm beads) beads with a FS threshold. Grey dots are background noise.


图3展示的是Apogee纳米流式细胞仪A50-Micro与其它流式细胞仪(F50、Gallios、Influx)的技术对比[2],通过前向角散射光FC500只能勉强区分0.5μm和0.9μm的微珠,0.5μm以下的微珠则完全无法区分;Gallios和Influx在散射光检测能力方面有所提高,可以区分0.3μm和0.5μm的微珠,但0.3μm以下的微珠还是无法区分;而Apogee A50-Micro可以轻松地将0.14μm的微珠和0.3μm的微珠分成两个群(Fig 1.A)。从前向角散射光和侧向角散射光的散点图中可以看到,无论是FC500还是Gallios或Influx都只能部分的将0.3μm的微珠与背景噪音区分开,而A50-Micro可以清晰地将0.3μm的微珠与背景噪音完全区分开(Fig1.B中绿色数据点),并且只有A50-Micro可以检测到0.14μm的微珠(Fig1.B中紫色数据点)。


这些结果充分说明Apogee纳米流式细胞仪在检测微小颗粒的优越性。利用Apogee A50-Micro突出的高灵敏度和分辨率(10nm),我们可以轻松地将直径相差10nm以上的细胞外囊泡样本进行分群、计数、分析。另外,多达9通道荧光检测器,可以灵活使用细胞外囊泡特定抗原荧光抗体进行快速、高通量、多参数检测囊泡来源和精确数量分析。


另外,由于外泌体(exosomes)的直径特别小(40 - 100nm),超出了传统流式细胞仪的检测范围,为此,很多公司提供了特异抗体标记的微珠用于外泌体的富集和流式分析,但这种方法的局限是操作复杂,对抗体特异性要求很高,而且无法知道外泌体的数量。而Apogee纳米流式细胞仪超高的灵敏度和分辨率使其可以直接对样本中的外泌体进行分析和计数,操作简单,结果准确。美国个性化医疗的领军生物技术公司Caris Life Sciences正是利用A50-Micro来检测和分析复杂病人样本中的微囊泡和外泌体[3]。


如果没有Apogee纳米流式细胞仪,不妨先选择试试ApogeeMix标准微球,让你的外泌体流式分析结果更准确!


[1] Chandler WL, Yeung W, Tait JF. A new microparticle size calibration standard for use in measuring smaller microparticles using a new flow cytometer. J Thromb Haemost. 2011 Jun;9(6):1216-24.

[2] Lacroix R, Robert S, Poncelet P, Dignat-George F. Overcoming limitations of microparticle measurement by flow cytometry. Semin Thromb Hemost. 2010 Nov;36(8):807-18.

[3] Abstracts from the Third International Meeting of ISEV 2014. Rotterdam, The Netherlands, April 30th – May 3rd, 2014. J Extracell Vesicles. 2014; 3:24214.

 

 



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